1　材料 
　　款冬藥材采自河北蔚縣款冬種植基地，分別采集2009年9月3日，10月1日，11月5日，12月3日及2010年3月4日的款冬花，陰干備用。經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心主任秦雪梅教授鑒定為菊科植物款冬T　farfara，樣品現(xiàn)保存于山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心。 
　　甲醇（天津市登峰化學(xué)試劑廠，批號(hào)20110725272，純度　995%），三氯甲烷（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20090223，純度　990%），娃哈哈純凈水，二十四烷（AlfaAesar，　純度>990%，　批號(hào)F14S034），MSTFA+1%TMCS　（Pierce　Chemical　Company，　USA，批號(hào)101043355），正庚烷（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)NK20402000，純度　995%），甲氧胺（上海晶純?cè)噭┯邢薰荆?hào)11190，純度　985%）。 
　　Trace　PolarisQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（配有電噴霧離子源及Xcalibur12數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)美國(guó)Thermo　Finnigan公司）；　LD5001電子天平　（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）；101系列恒溫干燥箱　（北京和同創(chuàng)業(yè)科技有限責(zé)任公司）；RE52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器　（上海亞榮生化儀器廠）。 
　　2　方法 
　　21　樣品制備 
　　將款冬花樣品液氮研磨至粉末，稱(chēng)取樣品30　mg于10　mL玻璃離心管中，加入CH3ClMeOHH2O　（2∶1∶1）　1　mL，聲提取30　min，3　000　r·min-1離心30　min，分為上層和下層。 
　　211　上層（甲醇水層極性部分）　取上清液250　μL，旋轉(zhuǎn)蒸干，殘?jiān)?0　μL鹽酸甲氧胺吡啶溶液（20　g·L-1），70　℃下反應(yīng)1　h，冷卻至常溫后，加50　μL　MSTFA+1%TMCS，37　℃下反應(yīng)30　min。后加入700　μL　正庚烷（含內(nèi)標(biāo)二十四烷01　g·L-1），轉(zhuǎn)移至GC進(jìn)樣小瓶，渦旋1　min，045　μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行GCMS分析。 
　　212　下層（氯仿層非極性部分）　將所有氯仿層移至25　mL圓底燒瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸干，加入600　μL的硫酸甲醇溶液（5%），50　℃反應(yīng)30　min，冷卻至室溫，加入200　μL水和200　μL正庚烷，振搖使分層，正庚烷層依次用200　μL碳酸氫鈉水溶液（5%）和200　μL的氯化鈉水溶液（5%）洗滌，正庚烷層加入無(wú)水硫酸鈉干燥24　h，之后將其移出旋轉(zhuǎn)蒸干，加入200　μL正庚烷（含內(nèi)標(biāo)二十四烷01　g·L-1），轉(zhuǎn)移至GC進(jìn)樣小瓶，渦旋1　min，045　μm微孔濾膜過(guò)濾，進(jìn)行GCMS分析。 
　　22 色譜條件 
　　221色譜柱　J&W　DB5MS毛細(xì)管柱（025　mm×30　m，025　μm）；進(jìn)樣口溫度　280　℃；載氣（He）流速10　mL·min-1，不分流。 
　　222 甲醇水層升溫程序　50　℃保持1　min，以每分鐘10　℃升至190　℃，保持1　min；以每分鐘3　℃升至210　℃，保持1　min，后以每分鐘7　℃升至280　℃，保持5　min。溶劑延遲時(shí)間為4　min，進(jìn)樣量1　μL。 
　　223　氯仿層升溫程序　50　℃保持2　min，以每分鐘15　℃升至160　℃，保持1　min；以每分鐘8　℃升至210　℃，保持1　min，后以每分鐘5　℃升至280　℃，保持5　min。溶劑延遲時(shí)間為5　min，進(jìn)樣量2　μL。 
　　23　質(zhì)譜條件 
　　電子轟擊（EI）離子源；電子能量70　eV；傳輸線溫度280　℃；離子源溫度200　℃；質(zhì)量掃描范圍m/z　60～800。 
　　24　數(shù)據(jù)分析 
　　所有的GCMS原始數(shù)據(jù)通過(guò)GCMS儀器工作站軟件Xcalibur由RAW格式轉(zhuǎn)化為netCDF格式。GCMS圖譜經(jīng)XCMS軟件預(yù)處理后（XCMS參數(shù)：fwhm75，　snthresh2，　max300，　group　bw10），導(dǎo)入Excel中對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行面歸一化，之后將歸一化的數(shù)據(jù)導(dǎo)入代謝組學(xué)軟件SIMCAP　110　軟件包（瑞典，　Umetrics　AB，　Umea），對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ctr標(biāo)準(zhǔn)化之后進(jìn)行主成分分析（principal　component　analysis，PCA）和偏小二乘法判別分析（partial　least　squares　discriminant　analysis，PLSDA），通過(guò)載荷圖（SPlot　loading圖）中的VIP（每個(gè)主成分變量對(duì)分開(kāi)各組的貢獻(xiàn)大小）來(lái)尋找生物標(biāo)志物，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)（NIST05）檢索匹配結(jié)合對(duì)照品對(duì)部分代謝物進(jìn)行指認(rèn)，并通過(guò)計(jì)算各個(gè)標(biāo)志物的內(nèi)標(biāo)歸一化后的相對(duì)峰面積含量來(lái)進(jìn)行定量分析，并且采用常規(guī)統(tǒng)計(jì)分析SPSS　115軟件進(jìn)行方差分析，結(jié)果用±s表示，顯著性差異比較采用t檢驗(yàn)。3　結(jié)果與分析 
　　31　代謝物的指認(rèn) 
　　甲醇水層通過(guò)衍生化反應(yīng)得到氨基酸，有機(jī)酸和糖類(lèi)，其典型總離子流色譜圖見(jiàn)圖1；而氯仿層經(jīng)過(guò)甲酯化得到的均為非極性小分子和脂肪酸類(lèi)化合物，其典型總離子流色譜圖見(jiàn)圖2。氨基酸的指認(rèn)是結(jié)合NIST05數(shù)據(jù)庫(kù)，再通過(guò)與對(duì)照品的保留時(shí)間和離子碎片對(duì)照而確定的，見(jiàn)圖3。目標(biāo)峰在樣品色譜圖中的保留時(shí)間與標(biāo)品的保留時(shí)間一致，而且離子碎片情況也基本一致，故確定其為天冬酰胺。其余色譜峰的結(jié)構(gòu)指認(rèn)方法同上，共指認(rèn)出氨基酸11個(gè)，有機(jī)酸8個(gè)，糖類(lèi)5個(gè)，脂肪酸10個(gè)和甾醇類(lèi)化合物2個(gè)，此外還包括香橙烯及其他的一些長(zhǎng)鏈烷烴類(lèi)低極性化合物。 
　　圖5表明，散點(diǎn)圖上可以看出極性部分各個(gè)組與采收期在X軸上均能明顯分開(kāi)，從Spslot載荷圖（b）中可以得到每2組的差異代謝物。從圖中可以得到，在發(fā)育初期的9月，其磷酸、甘油、蘋(píng)果酸、檸檬酸、蔗糖和葡萄糖的含量較高，而發(fā)育中期的脯氨酸和賴(lài)氨酸的含量明顯升高；3月款冬樣品與采收期相比，開(kāi)花后的脯氨酸、賴(lài)氨酸和蔗糖的含量降低，蘋(píng)果酸、檸檬酸、果糖和葡萄糖的含量則呈升高的趨勢(shì)。 
　　2個(gè)不同采集月份與傳統(tǒng)采收期的款冬花蕾樣品相比得到的多元統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)圖6，散點(diǎn)圖上可以看出非極性部分發(fā)育初期和開(kāi)花后與采收期10—12月份在X軸上均能明顯分開(kāi)，從圖6中SPlot載荷圖（b）中可以得到每2組的差異代謝物。與發(fā)育中期相比，在發(fā)育初期的9月，其棕櫚酸、亞油酸、亞麻酸、硬脂酸的含量較高，香橙烯、花生四烯酸和谷甾醇的含量較低；在開(kāi)花后的3月，其亞油酸的含量降低而花生四烯酸和谷甾醇的含量升高。 
　　由以上標(biāo)志代謝物的含量比較可以看出，差異主要體現(xiàn)在蔗糖、葡萄糖、脯氨酸、賴(lài)氨酸、蘋(píng)果酸、檸檬酸、亞油酸、花生四烯酸和谷甾醇這9個(gè)共同的特征性差異代謝物含量上，故對(duì)其相對(duì)含量進(jìn)行了t檢驗(yàn)分析和比較，柱狀圖見(jiàn)圖7。從圖中可明顯看到，脯氨酸和賴(lài)氨酸在花蕾發(fā)育初期含量較低，隨著不斷生長(zhǎng)發(fā)育逐漸升高，開(kāi)花后急劇下降；蘋(píng)果酸和檸檬酸在發(fā)育初期較高，中期降低，開(kāi)花后回升至接近初期水平；蔗糖的含量是呈逐漸下降趨勢(shì)，在開(kāi)花后降到低；葡萄糖在發(fā)育初期含量較高，隨著生長(zhǎng)其含量不斷下降至低，而在開(kāi)花后又回升至較高水平；谷甾醇的含量從發(fā)育初期到開(kāi)花后是逐漸升高的。亞油酸在發(fā)育初期較低，逐漸升至高，開(kāi)花后顯著降低；而花生四烯酸則是呈相反的趨勢(shì)，12月份降至低，而在開(kāi)花后升至高。 
　　4 討論 
　　崔貴梅等[8]曾對(duì)款冬花序芽的分化過(guò)程進(jìn)行了觀察，結(jié)果表明款冬從7月上旬至10月初經(jīng)歷花芽分化，因?yàn)榛ㄑ糠只馕吨参飶臓I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)轉(zhuǎn)向 生長(zhǎng)，因此款冬花在越冬前后一定有營(yíng)養(yǎng)積累和轉(zhuǎn)化的過(guò)程。蔗糖是高等植物光合作用的主要產(chǎn)物，是多數(shù)植物體內(nèi)運(yùn)輸碳水化合物的主要形式，為植物的生長(zhǎng)發(fā)育提供物質(zhì)和能量。款冬在未出土的發(fā)育初期9月到出土開(kāi)花后的3月，蔗糖逐漸轉(zhuǎn)化為其它營(yíng)養(yǎng)和能量物質(zhì)，其含量隨著花蕾的發(fā)育逐漸降低。有機(jī)酸中的檸檬酸和蘋(píng)果酸是三羧酸循環(huán)的重要中間產(chǎn)物，其含量在發(fā)育初期高，發(fā)育中期急劇降低，其含量降低的原因可能在于花蕾的發(fā)育中期需要的能量，有機(jī)酸轉(zhuǎn)化為糖類(lèi)為花蕾的發(fā)育提供能量。在花蕾發(fā)育中期，可能由于所需能量較多，葡萄糖也參與到能量供應(yīng)中，通過(guò)糖酵解使其發(fā)生氧化而減少。氨基酸屬于植物中的一大類(lèi)初生代謝產(chǎn)物，生物體內(nèi)氨基酸的主要作用是合成蛋白質(zhì)或其他含氮化合物，在植物體內(nèi)，特別是當(dāng)種子萌發(fā)時(shí)，蛋白質(zhì)發(fā)生強(qiáng)烈的降解作用，產(chǎn)生的氨基酸被重新利用形成幼苗中的蛋白質(zhì)。故在本實(shí)驗(yàn)中，款冬花蕾樣品中脯氨酸和賴(lài)氨酸初期含量較低，而后逐漸累積升至高，在開(kāi)花后又急劇下降，可能是由于在花蕾的生長(zhǎng)發(fā)育初期蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為氨基酸，故氨基酸逐漸增多，中期含量升至高，開(kāi)花后由于能量需求降低氨基酸則又合成為蛋白質(zhì)，故其含量急劇降低。除此之外，脂肪酸也是一類(lèi)重要的能量物質(zhì)，亞油酸在花蕾發(fā)育過(guò)程中是呈先升高后降低的趨勢(shì)，而花生四烯酸則是相反的趨勢(shì)，其變化的機(jī)制尚不明確。 
　　由于款冬花中次生代謝產(chǎn)物含量相對(duì)于初級(jí)代謝產(chǎn)物要低很多，而且NIST數(shù)據(jù)庫(kù)中收載的僅為常見(jiàn)化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，因此本實(shí)驗(yàn)中解析的化合物均為初級(jí)代謝產(chǎn)物，下一步將會(huì)采用傳統(tǒng)的植化方法對(duì)款冬花中次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行系統(tǒng)分離，進(jìn)而通過(guò)得到的次生代謝產(chǎn)物對(duì)照品進(jìn)一步指認(rèn)款冬花中的次生代謝產(chǎn)物。 
　　本草記載中款冬花為花蕾未開(kāi)花時(shí)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)方可采收，并未明確指出具體采收時(shí)期，目前尚沒(méi)有科學(xué)的依據(jù)來(lái)做指導(dǎo)，導(dǎo)致市場(chǎng)上款冬花蕾質(zhì)量參差不齊。本研究從化學(xué)的角度闡明10月、11月、12月的代謝組成相近，但合理的采收期還需要通過(guò)藥效試驗(yàn)以及分析不同產(chǎn)地以及不同年份種植的樣品進(jìn)一步研究確定。 
　　通常認(rèn)為，中藥的活性成分為次生代謝產(chǎn)物，其質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)也多為次生代謝產(chǎn)物。如2010年版《中國(guó)藥典》中規(guī)定，以款冬酮的含量評(píng)價(jià)款冬花的質(zhì)量。然而，中藥中還存在著的初級(jí)代謝產(chǎn)物，如氨基酸、糖類(lèi)、有機(jī)酸和脂肪酸等。此外，按照中醫(yī)傳統(tǒng)，中藥多以水煎入藥，在煎出次生代謝產(chǎn)物的同時(shí)，初級(jí)代謝產(chǎn)物也被煎出。款冬中的初級(jí)代謝產(chǎn)物雖然沒(méi)有直接的止咳化痰作用，但是近有研究[15]報(bào)道，一些氨基酸、有機(jī)酸和糖類(lèi)可能作為天然低共溶溶劑（natural　deep　eutectic　solvents，NADES）存在于生物細(xì)胞，被認(rèn)為是細(xì)胞中的第3種液體，即天然離子液體。而植物細(xì)胞中包含的次級(jí)代謝產(chǎn)物屬于中等極性的化合物，如蘆丁、槲皮素等，其高濃度時(shí)既不溶于水也不溶于脂類(lèi)（細(xì)胞膜），而該研究發(fā)現(xiàn)蘆丁在NADES中的溶解度是水中的50～100倍。因此，可能作為細(xì)胞內(nèi)天然離子液體的這些初級(jí)代謝產(chǎn)物，其含量與次生代謝產(chǎn)物的含量有著密切的關(guān)系。此外，這些初級(jí)代謝產(chǎn)物在中藥內(nèi)存在，其組成變化直接影響中藥的均一性，因此，這些化合物的含量雖然與中藥的有效性無(wú)直接關(guān)系，但對(duì)于中藥的均一性控制非常重要。中藥的作用特點(diǎn)為多成分多靶點(diǎn)協(xié)同作用，這些初生代謝產(chǎn)物對(duì)于藥效發(fā)揮的協(xié)同作用值得進(jìn)一步研究。